流感A病毒RNA结合蛋白TDP-43在病毒复制中的作用

• 导读

• A型流感病毒（IAVs）是重要的人类和动物病原体，其基因组由八个负极性RNA片段（vRNA）编码，每个vRNA与核蛋白（NP）一起被包装，并与一个拷贝的病毒RNA依赖RNA聚合酶（FluPol）形成大分子复合物，称为病毒核糖核蛋白（vRNPs）。

• 这些病毒在宿主细胞核中转录和复制基因组，利用“帽抓取”机制合成mRNA，八个vRNA片段中的三个（M、NS和PB2片段）产生剪接和未剪接的mRNA，从而扩展了病毒基因组的编码能力。然而，对于一些转录本，特别是早期未剪接的病毒mRNA，核外转运的机制尚不清楚。

• 在真核细胞中，各种蛋白质在mRNA转录和加工过程中与mRNA结合形成mRNA-蛋白质复合物（mRNPs），mRNPs的组成因mRNA的性质和生命周期步骤而异。尽管已经在全局水平上探索了与细胞mRNA相关的蛋白质的格局，但对特定细胞mRNA的相互作用却知之甚少。

• 流感病毒正在利用宿主转录、剪接和核外转运机制来确保有效的病毒基因表达。到目前为止，大家对与病毒mRNA一起组装形成病毒mRNPs的蛋白质知之甚少，这些RNA结合蛋白（RBPs）如何控制剪接和未剪接病毒mRNA的命运以及它们在细胞质中的传递到细胞翻译机制还有待研究。

• 2024年4月30日，法国国家科学研究中心Nadia Naffakh团队在Nucleic Acids Research上发表了一篇题为“The RBPome of influenza A virus NP-mRNA reveals a role for TDP-43 in viral replication”的论文，文章揭示了病毒感染至关重要的细胞因子，首次提供了对流感病毒mRNP组成和功能的见解，并揭示了转录的病毒聚合酶在招募细胞RNA结合蛋白到病毒mRNA上的重要作用。
  

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• 文章索引

• 【标题】The RBPome of influenza A virus NP-mRNA reveals a role for TDP-43 in viral replication

• 【发表期刊】Nucleic Acids Research

• 【发表日期】2024年4月30日

• 【作者及团队】法国国家科学研究中心Nadia Naffakh团队

• 【IF】16.97

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• 研究结果

• 一. 在感染的人类细胞中鉴定与流感病毒NP-mRNA结合的细胞蛋白

• 为了鉴定与流感病毒NP-mRNA直接互动的细胞因子，作者采用了增强的RNA相互作用捕获方法（eRIC）。在高MOI感染的A549细胞中，使用带有锁定核酸酸（LNA）修饰的捕获探针，并结合了严格的捕获和洗涤条件。

• 通过质谱分析，团队发现了与病毒NP-mRNA结合的细胞蛋白。进一步分析得出了一个高可信度的核心相互作用组，其中包括与IAV生命周期相关的蛋白。

• 结果表明，NP与病毒mRNA可能存在直接结合，这与NP对RNA磷酸骨架的结合方式一致，但并未在实验中发现病毒聚合酶亚基的富集。

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• 二. 病毒mRNA结合蛋白的生物功能

• 作者对NP-mRNA相互作用组进行了GO富集分析，发现了与RNA代谢和剪接相关。这些蛋白主要是hnRNPs，它们具有重复的RNA结合结构域。

• 与全局多聚A-mRNA相互作用的数据集比较后发现，大多数NP-mRNA结合蛋白与之重叠，表明它们是细胞中特定的多聚A-mRNA相互作用蛋白。

• 此外，这些蛋白也在病毒RNA相互作用组中出现，提示不同病毒可能利用相似的RNA生物合成途径。

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• 三. 促进病毒感染的病毒mRNA结合蛋白的鉴定

• 研究团队使用siRNA沉默了NP-mRNA核心相互作用组中的每个RBP，以鉴定其对病毒感染的影响。结果显示，hnRNPA2B1、hnRNPH1、TDP-43、SF3A3和SF3B4促进了病毒感染。

• 通过CLIP-qPCR进一步证实了这些蛋白与病毒NP-mRNA的结合。这些蛋白与病毒mRNA的结合优先于其他RNA形式，如病毒RNA和细胞RNA。
  

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• 四. TDP-43敲除后细胞中的病毒复制受阻

• 作者使用CRISPR Cas9在A549细胞中敲除了TDP-43，并观察到敲除后感染流感病毒后病毒复制和产量下降。

• 通过重新表达TDP-43，又成功地恢复了病毒复制和产量，这表明TDP-43在流感病毒基因表达中扮演着重要角色。

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• 五. 病毒聚合酶介导TDP-43与病毒mRNA的结合

• 作者研究了TDP-43是否结合除了NP-和NA-mRNA之外的其他病毒mRNA。他们发现，各种病毒mRNA在与TDP-43的共免疫沉淀中都显示了显著的富集，这种结合效率与病毒转录本的丰度并不一致。

• 进一步的实验表明，TDP-43主要通过转录的病毒RNA聚合酶被招募到病毒mRNA上。除此之外，还证实了病毒RNA聚合酶和TDP-43在感染过程中存在物理上的相互作用，这可能对流感病毒的基因表达至关重要。

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• 六. TDP-43的C端域对于与病毒RNA聚合酶和病毒NP-mRNA的结合至关重要

• 作者研究了TDP-43与流感病毒转录机制的相互作用及其结构域的作用。他们发现TDP-43的N端、中部和C端结构域以及其二聚化和RNA结合对其在增强流感病毒生长中的作用至关重要。

• 进一步实验证明，TDP-43与病毒RNA聚合酶的相互作用主要是通过其无序的C端结构域介导的。这表明病毒RNA聚合酶通过与TDP-43的直接相互作用，而非RNA结合，将其招募到mRNPs中。

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• 总结

• 本文研究了流感病毒mRNA与RBPs的相互作用，并发现TDP-43是一个重要的结合蛋白。TDP-43的缺失导致流感病毒mRNA和蛋白水平下降，传染性病毒颗粒也减少。其他与流感病毒mRNA相关的RBPs也与病毒聚合酶相互作用，表明病毒聚合酶在组装病毒信使核蛋白中发挥着重要作用。

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