Mol Cell | 李笑雨和伊成器开发全新碱基分辨率级m⁵C测序技术

导读

研究学者们在各种RNA类型中已经发现了超过170种转录后修饰，它们在基因表达调控中发挥着多样的作用。其中，5-甲基胞嘧啶（m5C）是一种常见的RNA修饰，存在于rRNA、tRNA和mRNA中。

在mRNA中，m5C可以被特定识别蛋白（如ALYREF、YBX1、YBX2、FMRP和SRSF2）识别，并调控RNA代谢的各个方面，包括输出、稳定性、剪接和翻译。

全面了解RNA修饰需要准确和灵敏的检测技术。与m6A甲基化相比，m5C在mRNA中的修饰水平较低，需要强大的检测方法来区分真实信号和假阳性。目前最常用的m5C检测方法是RNA亚硫酸氢盐测序（BS-seq）。

在BS-seq中，未修饰的胞嘧啶（C）被转变为尿嘧啶（U），而m5C保持不变，从而标记未转换的C为m5C。然而，BS-seq面临以下挑战：

1）依赖C完全转变为U，结构化区域的转换不完全会导致假阳性

2）苛刻反应条件导致RNA降解，阻碍低输入样本和低丰度RNA的检测

3）C转变为U降低了序列复杂性，影响文库构建和测序质量。

这些限制使得对m5C的全面理解变得困难，特别是在mRNA中，不同研究对m5C位点的数量仍有争议。

2024年7月12日，浙江大学医学院李笑雨与北京大学生命科学学院伊成器团队在Molecular Cell上发表了一篇题为“Base-resolution m5C profiling across the mammalian transcriptome by bisulfite-free enzyme-assisted chemical labeling approach”的论文，文章开发了一种无BS、碱基分辨率的m5C检测方法——m5C-TAC-seq（TET辅助化学标记）。该方法对RNA温和，允许在低丰度和低序列复杂性的RNA中直接检测m5C，可用于研究不同RNA物种和生物学背景下的m5C甲基化。

文章索引

【标题】Base-resolution m5C profiling across the mammalian transcriptome by bisulfite-free enzyme-assisted chemical labeling approach

【发表期刊】Nature Biotechnology

【发表日期】2024年7月12日

【作者及团队】浙江大学医学院李笑雨与北京大学生命科学学院伊成器团队

【IF】46.9

研究结果

一. TET辅助选择性化学标记实现了稳健且灵敏的RNA m5C检测

在之前的研究中，作者展示了AI可选择性标记DNA中的5fC，实现高效的C到T转换，用于全基因组5fC分析。研究团队设想TET能将RNA中的m5C氧化为f5C，并用AI标记以引发C到T转换，实现转录组范围内的m5C检测。

实验结果显示，AI标记高效温和，能实现f5C RNA的30倍富集，并诱导高C到T转换率（93%-98%）。验证表明，TET酶可以将RNA m5C氧化为f5C，AI标记几乎标记了所有新生成的f5C（99%），且保持RNA完整性。

总体而言，m5C-TAC策略灵敏、特异，对RNA影响较小，适用于稳定的m5C检测。

二. m5C-TAC-seq实现了半定量和基因组分辨率的RNA m5C分析

作者在转录组水平评估了其应用，并采用多重文库构建策略，减少起始材料使用量和样本间技术差异。

通过混合不同比例的未修饰C和完全修饰m5C进行m5C-TAC-seq，结果显示即使在2.5%甲基化水平下，m5C-TAC-seq仍能可靠地区分m5C和未修饰C。这一方法能够半定量地揭示m5C在多种生物过程中的动态变化。

三. m5C-TAC-seq揭示了rRNA和小非编码RNA中的额外m5C位点

作者利用m5C-TAC-seq分析了mESCs中的tRNA和rRNA，发现了200个共享的m5C位点，证明其高可重复性。

在rRNA中，他们确认了两个已知的m5C位点，并额外发现了一个新的m5C3683位点。通过基因敲除验证，确认了NSUN2在m5C3683的甲基化中的作用。

此外，m5C-TAC-seq还成功识别了在低丰度非编码RNA中的m5C位点，并确定了它们的甲基转移酶。

四. 人类转录组中基本分辨率的全面m5C景观

在HeLa和HEK293T细胞中应用m5C-TAC-seq，作者检测到大约2,499个和765个高度可复制的m5C位点。这些位点主要分布在mRNA的编码序列（CDS）和3'端非翻译区（3' UTR），显示出该方法的高精度和可靠性。

与BS-seq相比，m5C-TAC-seq不仅展示了更高的重现性和唯一映射比率，还能够检测到超过1,500个额外的m5C位点，尤其是那些低量程度的位点。

进一步的分析表明，m5C-TAC-seq对于mRNA m5C检测的稳健性和准确性，尤其是在酶依赖位点的鉴定上具有显著优势。

五. HeLa和HEK293T细胞之间的差异m5C甲基组

作者比较了HeLa和HEK293T细胞的m5C甲基组。

总体上，HeLa细胞中鉴定的m5C位点显著多于HEK293T，且这些位点主要由NSUN2和NSUN6催化。HeLa细胞特有的m5C位点表现出NSUN2依赖性，而HEK293T细胞特有的位点则表现出NSUN6依赖性。

进一步分析表明，m5C甲基化在RNA稳定性和翻译调控中起重要作用。

六. m5C甲基转移酶依赖的mESC m5C甲基组

在mESC mRNA中进行了m5C-TAC-seq，发现了664个m5C位点，验证了其准确性和灵敏度。

主要的m5C甲基转移酶包括NSUN2、NSUN5和NSUN6，分别催化了322、35和27个m5C位点。这些酶依赖位点在CDS和3'UTR区域中均有富集，突显了NSUN5的作用，并显示了m5C-TAC-seq在分析m5C动态变化中的可靠性。

七. mESC分化过程中动态调控的m5C甲基组

mESC分化中m5C甲基组动态调控研究发现，随着分化过程，Nsun2和Nsun5表达显著下降，Nsun6略有减少。

质谱分析显示mRNA的m5C甲基化水平减少约50%。m5C-TAC-seq进一步证实，大多数m5C位点在分化中呈现下调状态，涵盖421个下调位点和45个上调位点。

这些变化与相关基因表达水平的下降相对应，尤其是与细胞周期和分裂相关的基因。这些结果提示，动态调节的mRNA m5C甲基组可能对mESC的细胞命运决定起重要作用。

八. 共转录的caRNA中m5C沉积

作者通过质谱发现caRNA中存在m5C。由于重复序列和低丰度问题，采用m5C-TAC-seq鉴定出215个m5C位点，主要位于基因间区和内含子区域。m5C位点倾向于m5CNGG模体，暗示NSUN2可能在caRNA中起作用。这表明m5C可以在caRNA中沉积，增加了调控层次。

总结

本文开发的m5C-TAC-seq，无需重亚硫酸盐，通过TET辅助氧化和化学标记实现碱基分辨率的m5C检测。该方法识别了大量人类和小鼠细胞中的m5C位点，确定了大多数m5C位点的甲基转移酶，包括NSUN5在mRNA m5C沉积中的作用，并揭示了mESC分化过程中m5C的动态变化。

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