NAR | 用CRISPR/Cas13X实现基因翻译调控，开启生物合成新时代！

导读

合成生物学可构建微生物细胞工厂，将可再生原料转化为高价值化学品，对环境保护和循环经济具有重要意义。然而，微生物代谢网络复杂，资源优先用于细胞生长，影响目标产物产量。

近年来，动态调控工具（如可诱导启动子、基因回路）被用于优化代谢流，但多局限于转录水平。事实上，相比转录，翻译调控响应更快，且能独立调控多顺反子基因表达。

CRISPR-Cas系统因其高精度和可编程性广泛应用，可同时激活或抑制基因。现有CRISPR工具主要基于dCas9/dCas12a，局限于转录调控。相比之下，Cas13靶向RNA，可在翻译水平上调控基因表达，为代谢调控提供新思路。

枯草芽孢杆菌是广泛用于工业生产的安全微生物，研究已在其中构建基于dCas9/dCas12a的CRISPRi/a系统，但CRISPRa调控效果尚待提升。

2025年1月13日，江南大学刘龙团队在Nucleic Acids Research上发表了一篇题为“CRISPR/Cas13X-assisted programmable and multiplexed translation regulation for controlled biosynthesis”的论文，基于高保真Cas13X（hfCas13X），他们在枯草芽孢杆菌中开发了一种翻译水平调控的CRISPRi/a系统，首次在革兰氏阳性菌中实现了翻译水平的CRISPR调控，并创造了迄今最高的翻译激活效果，为菌株的代谢工程改造提供了新工具。

索引

【IF】16.97


研究结果

一. hfCas13X介导的CRISPRi系统的构建与优化

作者构建了DiCRISPRa系统，利用dhfCas13X结合crRNA靶向RNA降解标签，防止mRNA降解并激活基因翻译。

融合BHfq可增强调控效果，最高激活达2.8倍，但仍低于强启动子驱动的表达，限制了其应用潜力。

三. TsCRISPRa系统的设计、构建与优化

研究团队设计了基于翻译起始的CRISPRa（TsCRISPRa）系统，通过将踏步开关插入基因5′ UTR来控制基因表达。触发RNA可以打开踏步开关结构，激活下游基因表达。

通过优化踏步开关和触发RNA配对，并共表达dhfCas13X，团队显著提高了mcherry表达的激活效果。融合Hfq蛋白的dhfCas13X-BHfq也显著增强了系统的调控效果。

此外，dhfCas13X-BHfq也能作为CRISPRi系统抑制基因表达。

四. 使用CRISPRi/a系统对核黄素和2′-FL代谢网络进行多重精细调控

作者使用dhfCas13X-Bhfq系统调控核黄素和2′-FL代谢网络。在核黄素合成中，TsCRISPRa系统激活基因表达，使核黄素产量提高最高190%。

在2′-FL合成中，激活manB基因和抑制pfkA基因，成功提高2′-FL产量，证明该系统是有效的代谢工程调控工具。

总结

本研究开发了基于hfCas13X的CRISPRi和CRISPRa系统，调控芽孢杆菌中的基因翻译。通过增强mRNA稳定性或启动翻译，成功提高了核黄素和2′-岩藻糖乳糖的产量。融合RNA结合伴侣BHfq提高了系统效率，为基因翻译调控提供了新工具。

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