NAR | uORF翻译与结核杆菌非典型B12核酸开关之间的新型调控作用

导读

mRNA编码序列前的RNA先导物作为基因表达控制的枢纽已经引起了研究者们的兴趣。他们被称为核酸开关，是高度结构化的顺式调控RNA，可以感知并结合特定的代谢产物，从而影响受其控制的基因的表达。

核酸开关通过两个RNA结构域之间的相互作用来调控基因表达：配体结合域和表达平台。

A）配体结合域高度保守，形成独特的三维结构以结合配体；

B）表达平台通过根据配体结合域的配体结合状态采取互斥的次级结构来执行基因调控。

最近的研究表明，起源于基因中的上游开放阅读框（uORFs）的密码子和肽段可以正面或负面影响下游开放阅读框的表达水平。例如，存在于uORFs上的翻译核糖体可以调节下游基因的表达，但目前未解决核酸开关相关的uORFs如何影响基因表达的问题。

在过去的二十年中，已经发现了许多核酸开关家族，它们调控着各种细胞过程。其中最广泛的之一是结合辅酶B12（钴胺）的核酸开关，它们调控着与该辅酶的合成、转运或利用有关的基因。

结核病的病原体结核分枝杆菌，则缺乏合成B12的能力，这与cobF基因的缺失有关。最近的证据表明，这些生物体中的新生物合成B12的消失塑造了它们作为能够引起全身性感染的病原体的进化。然而，结核分枝杆菌编码了几种依赖B12的酶，这表明该病原体利用了宿主来源的B12。

2024年5月6日，伦敦大学学院结构与分子生物学研究所Kristine B Arnvig团队在Nucleic Acids Research上发表了一篇题为“A novel regulatory interplay between atypical B12 riboswitches and uORF translation in Mycobacterium tuberculosis”的论文，文章研究探讨了结核分枝杆菌的metE和ppe2核酸开关，并且发现了uORFs的翻译对下游编码区的表达影响显著。这些发现拓展对结核分枝杆菌中B12核酸开关调控机制的理解，同时揭示了该病原体中翻译控制的新细节。

文章索引

【标题】A novel regulatory interplay between atypical B12 riboswitches and uORF translation in Mycobacterium tuberculosis

【发表期刊】Nucleic Acids Research

【发表日期】2024年5月6日

【作者及团队】伦敦大学学院结构与分子生物学研究所Kristine B Arnvig团队

【IF】16.97

研究结果

一. metE和ppe2先导体的过早转录终止

作者发现了结核分枝杆菌RNA序列的过早转录终止位点，包括metE和ppe2。在添加AdoB12（腺苷钴胺素）后，metE的转录水平显著下降，而ppe2的变化较小。northern结果显示，metE和ppe2序列中分别出现了转录终止。这表明了B12依赖性转录终止，同时也突显了metE和ppe2之间的差异。

ppe2下游的cobQU基因与钴胺的合成有关，因此它们很可能是B12依赖性控制的靶点。为了确定cobQ是否与ppe2共转录并因此受到B12开关的调控，作者在ppe2-cobQ结合部位进行了qRT-PCR。结果表明，ppe2和cobQ是共转录的，添加AdoB12后RNA水平下降了10倍，这表明cobQ也受核酸开关的调控。

二. metE和ppe2适配体对B12异构体表现出不同的选择性

为了确定B12与metE和ppe2配体之间的直接相互作用，并确定每种配体的配体结合特性，作者通过体外转录生成了用于线型探针分析的转录物。

结果表明，metE核酸开关显示出对腺苷基B12的选择性，而ppe2核酸开关则对所有四种B12同分异构体都具有相似的结合模式。

三. B12结合导致metE翻译起始区的阻塞

团队通过预测结构显示了核糖开关的适配区域在引导序列中的位置，并发现了在AdoB12存在时表达平台的高剪切区域，该开关使用翻译起始区（TIR）遮挡实现翻译表达的调控。

四. metE内的短翻译ORF抑制MetE表达

结核分枝杆菌的核糖开关在注释基因上游编码了多个短的、翻译的ORFs。其中，umetE2可能影响核糖开关功能。

实验表明，uMetE2的翻译会增加MetE的表达，并保持B12感知的功能。这暗示着uMetE2可能在整体调控MetE表达中发挥作用。图片

五. ppe2前有一个受核糖开关控制的翻译序列

为了更详细地研究ppe2开关的结构-功能关系，作者对ppe2的引导序列进行了内联探针实验。结果显示，ppe2核糖开关的剪切受AdoB12的剂量依赖性调节，但其对AdoB12的亲和力较低。

研究团队预测了配体结合态的ppe2核糖开关的二级结构，结果显示与metE核糖开关相似，但也存在一些差异。此外，他们发现uPPE2可能是ppe2操纵子中的第一个调控目标，其表达水平高于PPE2。

六. PPE2的表达依赖于上游ORF的翻译

结核分枝杆菌中的数百个相邻ORFs在终止密码子和起始密码子之间共享一个4个核苷酸的NUGA重叠，这很可能影响下游ORF的翻译。PPE2的表达依赖于uPPE2的翻译，因为作者发现阻止uPPE2翻译的突变会显著降低PPE2的表达。

团队进行了一系列实验，结果显示，早期终止突变导致PPE2表达逐渐减少，而在PPE2起始密码子下游引入新的终止密码子会显著降低PPE2的表达。

这表明uPPE2的翻译对PPE2的表达起到了重要的调控作用，而rho依赖的终止并不完全解释这种现象，说明核糖体的前进运动对于下游ORF的高效表达是必要的。

七. PPE2主要通过终止-重启动机制进行翻译

作者通过在uPPE2-PPE2’-LacZ报告融合体中添加N端的FLAG标签来验证这一点。结果显示，主要的翻译机制是终止-重启动，但在少数情况下UGA终止密码子被抑制，产生了一个融合蛋白。

进一步的实验表明，添加FLAG标签会增加β-半乳糖苷酶（β-gal）活性，可能是由于对RNA或蛋白质的稳定作用。总之，PPE2的表达取决于uPPE2的翻译。

总结

本文首次证实了这些核酸开关与B12结合，并发现它们对B12的偏好、调控机制和结构元素有所不同，表现为翻译性的关闭开关。此外，文章还发现了metE和ppe2上游的短开放阅读框（uORFs），它们调节了下游基因的表达。这些发现揭示了B12感知核酸开关与翻译机制之间的新调控相互作用，突显了结核分枝杆菌中的调控复杂性。

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