Nature | 张峰学生发表全新的桥RNA基因编辑技术

导读

进化赋予了大量酶重新排列和多样化基因组的功能。这使得新基因的出现、免疫系统的发展以及病毒和移动遗传元件（MGEs）的传播成为可能。MGEs广泛存在，通常通过转座酶、整合酶、自剪切内切酶或重组酶进行移动，识别DNA的方式从位点特异性（如Cre和Bxb1重组酶）到半随机（如Tn5和PiggyBac转座酶）不等。

插入序列（IS）元件是简单的MGEs，广泛存在于细菌和古细菌中，通常使用自编码转座酶识别末端倒置重复序列（TIRs）。IS元件分为约28个家族，主要根据转座酶的催化残基分组，如DDE、DEDD等。

IS110家族元件是剪切和粘贴类型的MGEs，通过无痕切除和环化转座，使用DEDD催化基序，与RuvC解旋酶同源，缺乏TIRs，通常靶向微生物基因组中的重复元件。尽管IS110元件的DNA识别和重组机制尚不清楚，但先前的研究表明，重组酶开放阅读框两侧的非编码末端调节重组酶的表达。

2024年6月26日，加州大学伯克利分校生物工程系Patrick D. Hsu团队在Nature上发表了一篇题为“Bridge RNAs direct programmable recombination of target and donor DNA”的论文，文章展示了IS110环状形式驱动一种非编码RNA（ncRNA）的表达，该RNA具有两个结合环，分别识别IS110的DNA供体和插入靶位点，通过桥接供体和靶DNA，促进IS110重组酶的DNA重组。桥式RNA的结合环可以重新编程，以结合和重组不同的DNA序列，从而实现序列特异性的插入、倒位和切除。

值得注意的是，Patrick D. Hsu团队在2024年6月26日同日又发表了一篇Nature，通过解析桥RNA引导重组的结构，详细解释了其作用机制，进入公众号可查看此文章解读。

文章索引

【标题】Bridge RNAs direct programmable recombination of target and donor DNA

【发表期刊】Nature

【发表日期】2024年6月26日

【作者及团队】加州大学伯克利分校生物工程系Patrick D. Hsu团队

【IF】64.8

研究结果

一. IS621重组酶与一种非编码RNA（ncRNA）结合

IS110元件编码300-460个氨基酸的重组酶，具有DEDD RuvC样结构域和保守丝氨酸残基。这些重组酶通过无痕切除生成环状双链DNA，并插入特定基因组序列。

研究发现，IS110元件的切除重建了一个启动子，驱动ncRNA的表达。实验显示，IS621重组酶以高亲和力结合LE编码的ncRNA，这表明ncRNA在重组过程中发挥重要作用。

二. 非编码RNA（ncRNA）与靶DNA和供体DNA协调变化

作者分析了103个不同同源物的ncRNA共识次级结构，发现它包含一个5'茎环和两个内部环。第一个内部环变化较大，第二个内部环保守性较高。他们发现这些ncRNA可能与IS110元件的靶位点和供体DNA进行特定的碱基配对。

三. IS621 ncRNA连接靶位点和供体DNA

先前的研究仅在IS110宿主生物中成功，尚未在体外实现IS110元件的重组，作者发现ncRNA是体外重组的必需组分。

通过结合体外转录的ncRNA、纯化的IS621重组酶和靶位点及供体DNA序列的寡核苷酸，研究团队成功实现了重组。

四. 可编程靶位点选择

先前的研究仅在IS110宿主生物中成功，尚未在体外实现其重组。作者发现桥接RNA是体外重组所需的关键组分。

通过在大肠杆菌中建立双质粒重组系统，他们验证了桥接RNA在重组中的作用。使用WT IS621供体和靶位点，团队成功观察到了预期的重组产物。

进一步的实验表明，通过重新设计桥接RNA的靶结合环，作者可以实现对靶位点选择的编程，从而在不同靶序列上实现高效的重组。

他们还展示了桥RNA可以通过转录方式表达，并增强其在重组中的效率。通过详细的错配耐受性和重新编程规则评估，确认了桥接RNA在靶位点特异性重组中的可编程性和精确性。

五. 可编程插入E. coli 基因组

使用WT IS621和桥RNA，作者在E. coli基因组中插入了一个带有22-bp WT供体序列的质粒。

他们检测到了173个独特的插入位点，其中144个位点位于已知的IS621靶向的REP元件内。几乎所有插入位点（96.21%）与自然环境中观察到的目标序列或桥接RNA编码的特异性高度吻合。

通过引入延伸的RTG序列，作者显著提高了插入到目标位点的特异性，并减少了非靶位点的插入。

此外，作者还观察到少量基因组内部的删除和倒转事件。这些实验结果展示了IS621在选择性插入特定位点和揭示其重组机制方面的强大能力。

六. 编程桥接RNA的供体特异性

IS621元素中，供体序列比基因组目标序列更保守，表明供体结合环不容易像目标结合环那样重编程。

作者设计了一个供体特异性筛选系统，发现供体序列可以完全重编程。这表明桥接RNA允许模块化地重编程目标和供体DNA识别。

七. 可编程的DNA重排

除了用于DNA插入，像Cre这样的重组酶通常还用于DNA序列的切除或倒转。预先安装loxP识别位点可实现位点同向切除和异向倒转。

IS621重组酶据推测能够实现可编程的切除和倒转，展示了控制多种DNA重排的潜力。

八. 多样的IS110元件编码桥RNA

作者研究了IS110家族中桥RNA的普遍存在。这个家族分为IS110和IS1111两组，后者具有较长的重复元素（RE），与IS110相反。

通过RNA结构模型预测，他们发现大多数IS110和IS1111元素可能编码桥RNA，它们能够特异地与靶位点和供体序列进行碱基配对。

总结

IS110插入序列是一类简化且自主的移动基因元件，通过表达结构化的非编码桥接RNA与其编码的重组酶特异性结合。桥RNA含有两个内部环，能够独立重新编程目标结合环和供体结合环，实现DNA分子之间的特异性序列重组。这一系统不仅支持DNA插入到基因组位点，还能进行可编程的DNA切除和倒置，扩展了核酸引导系统的应用领域，为基因组设计提供了统一的重排机制。

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