NC | 基于dCas13的系统调节基因翻译水平

导读

开发合成基因表达调节器，如CRISPR-Cas系统和合成sRNA，使得高通量筛选基因并改造微生物代谢途径成为可能：

A）失活的Cas9（dCas9）或Cas12（dCas12）可特异性结合双链DNA，阻断转录并沉默基因表达

B）合成sRNA与Hfq蛋白一起结合mRNA，用于在翻译水平抑制基因表达。

 Cas13不同于Cas9和Cas12，它可以特异性切割单链RNA。虽然Cas13的活性状态会导致邻近RNA的非特异性降解，限制了其作为基因敲降工具的应用，但失活状态的Cas13（dCas13）可以通过隔离mRNA翻译起始区来抑制基因表达，但不影响细胞生长。

此外，通过将翻译起始因子融合到dCas13上，在翻译水平上实现了基因激活。

然而，dCas13的基因敲降或激活仅在单顺反子基因的简单开/关调控中进行了测试。作为合成基因表达调节器，dCas13的特异性或多重性等特性尚未详细研究。缺乏可以适度调节dCas13基因表达的策略限制了其在细菌细胞中的应用，无法与其他特征良好的合成基因调控系统相提并论。

2024年6月22日，首尔国立大学化学与生物工程学院Sang Woo Seo团队在Nature Communications上发表了一篇题为“Tunable translation-level CRISPR interference by dCas13 and engineered gRNA in bacteria”的论文，文章开发了基于dCas13的可调节Tl-CRISPRi系统，能精确调节不同细菌中多种基因的翻译水平，该系统有望成为细菌中一种稳健且可预测的翻译水平基因调控工具。

文章索引

【标题】Tunable translation-level CRISPR interference by dCas13 and engineered gRNA in bacteria

【发表期刊】Nature Communications

【发表日期】2024年6月22日

【作者及团队】首尔国立大学化学与生物工程学院Sang Woo Seo团队

【IF】16.6

研究结果

一. 基于dCas13的Tl-CRISPRi系统的设计与探索

通过基因组挖掘，作者选择了四种Cas13同源物并生成dCas13蛋白。实验显示，只有dRfxCas13d显著降低了mCherry基因表达至2.8%，且对细菌生长无影响，故团队选择dRfxCas13d构建Tl-CRISPRi系统。

验证结果显示，Tl-CRISPRi能在染色体不同位置有效敲降基因，并特异且同时抑制多个基因。

Tl-CRISPRi也能高效抑制质粒转录的mRNA翻译，且转录速率对表达水平影响不大。

研究还显示，Tl-CRISPRi适度减少目标mRNA数量，通过阻止翻译起始位点隔离核糖体，实现基因抑制。

二. 通过Tl-CRISPRi调节多顺反子操纵子的表达

在多顺反子操纵子中，传统Tx-CRISPRi会关闭下游所有基因的表达，产生极性效应。

作者假设Tl-CRISPRi可以独立抑制每个基因而不影响邻近基因。实验表明，Tl-CRISPRi在靶向上游基因时不会显著影响下游基因表达，而Tx-CRISPRi会导致下游基因表达大幅降低。

在靶向非必需上游基因时，Tl-CRISPRi对细菌生长影响较小，而Tx-CRISPRi会导致生长迟缓。这表明Tl-CRISPRi能有效调控目标基因表达，减少极性效应。

三. 通过Tl-CRISPRi工程化引导RNA柄序列实现可调节抑制

作者探索通过突变引导RNA的直接重复序列（DR）实现Tl-CRISPRi的可调节性。

系统突变引导RNA的干茎、膨胀区和侧翼序列，创建了不同DR序列的引导RNA，用于敲降mCherry，基因表达水平在2.6%到86.3%之间，并且突变的DR在其他基因中也有效。

研究团队还在需钠弧菌中验证了该系统的有效性，展示了其在不同微生物系统中精确调节基因表达的潜力。

四. 应用Tl-CRISPRi优化代谢通量

作者利用Tl-CRISPRi技术调节内源基因表达，优化代谢通量以增强有价值化合物的生产。

他们选定将丙二酰辅酶A转化为3-羟丙酸的途径，通过敲除关键基因如fabI显著提高了3-羟丙酸的产量，最高达到1.87 g/L，是未敲除菌株的11.1倍。

采用组合基因敲除策略，如同时敲除aceE和fabZ，进一步提升了产量。

尽管完全抑制脂肪酸合成有助于增产，但也显著抑制了微生物的生长。因此，作者尝试采用调节剂量的引导RNA来实现对fabI基因的适度抑制，以在大规模和高浓度碳源条件下保持高产。

总结

CRISPR-dCas13用于调控基因翻译水平表达，但精确控制仍有挑战。本文开发了Tl-CRISPRi系统，通过工程化指导RNA实现精准和可预测的mRNA翻译抑制。优化后的Tl-CRISPRi系统能特异和多重抑制基因翻译，尤其适用于独立调控多基因共价链中的各基因。调整指导RNA结构后，成功在大肠杆菌和嗜盐弧菌中实现多基因的可调抑制。该系统展示了在RNA靶向技术微生物工厂中优化通量的潜力。

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