Mol Cell | 不依赖连接的建库方法LIDAR揭示3'末端封闭的tRNA衍生RNAs

导读

原核细胞和真核细胞合成的RNA种类繁多，大小和功能各异。RNA分类的一个标准是其编码能力，这区分了编码蛋白质的RNA（mRNA）和非编码RNA（ncRNA）。

非编码RNA包括结构性ncRNA（如rRNA和tRNA）、参与剪接和rRNA生成的snRNA和snoRNA，以及调控性ncRNA（如piRNA、miRNA和lncRNA）。大多数调控性ncRNA小于50个核苷酸，而大于500个核苷酸的称为lncRNA。

RNA-seq可以在转录组水平上检测和定量RNA。文库构建技术大致分为三类：mRNA-seq、Smart-seq和小RNA-seq。

A）在mRNA-seq中，多腺苷酸化（poly(A)+）的mRNA被纯化、片段化，通过随机引物逆转录（RT）转化为cDNA，并连接接头进行扩增和测序。这些方法扩展到非poly(A)转录本，通过去除rRNA并跳过oligo(dT)纯化。

B）Smart-seq基于模板转换，从有限的mRNA中生成高复杂度的文库，包括单细胞的mRNA。

C）mRNA-seq和Smart-seq都无法捕获小RNA，这些小RNA通常通过在5'和3'末端直接连接接头，然后通过RT合成cDNA进行测序。

尽管这种方法已经取得成功，但它只能克隆末端具有特定化学结构的RNA，因为接头连接需要5'端有磷酸基（5'P）和3'端有羟基（3'OH）。

一些ncRNA在末端带有化学修饰，妨碍了标准的连接方法。尽管已经实施了各种策略来克服这一限制，但它们需要事先了解化学末端以进行“修复”。因此，需要一种不依赖连接的小RNA方法，理想情况下还能捕获较长的RNA。

2024年8月2日，宾夕法尼亚大学Roberto Bonasio团队在Molecular Cell上发表了一篇题为“A ligation-independent sequencing method reveals tRNA-derived RNAs with blocked 3′ termini”的论文，介绍了一种新的非连接依赖方法（LIDAR），能检测所有类型的RNA，无论其大小或末端化学结构。LIDAR成功捕获了小鼠胚胎干细胞、组织和精子中的RNA，包括完整的tRNA和之前未检测到的3'末端封闭的tRNA衍生RNA。

文章索引

【标题】A ligation-independent sequencing method reveals tRNA-derived RNAs with blocked 3′ termini

【发表期刊】Molecular Cell

【发表日期】2024年8月2日

【作者及团队】宾夕法尼亚大学Roberto Bonasio团队

【IF】15.58

研究结果

一. LIDAR捕获小RNA

随机六聚体引物广泛用于cDNA合成，但由于难以分离小插入片段与接头二聚体，因此未用于小RNA克隆。LIDAR方法无需尺寸选择即可抑制接头二聚体，从而克隆小RNA。

作者测试了20nt和50nt的RNA，从0.6 ng的输入RNA中获得正确大小的产物，显示出良好的敏感性和覆盖率。

在小鼠胚胎干细胞的总RNA测试中，LIDAR成功构建了文库，包含大量小插入片段（<100 bp），但少于传统连接文库。

LIDAR捕获了大量结构性RNA（如rRNA）和短RNA（如snoRNA、snRNA、tRNA），并能覆盖整个miRNA长度。

总之，LIDAR是一种高效、非连接依赖的方法，可以快速测序各种大小和类型的RNA。

二. 同时检测差异表达的蛋白质编码RNA和小RNA

为了捕获所有大小的RNA，包括小RNA，作者省略了Smart-seq3的标签化步骤，使LIDAR能够检测各种大小的RNA。LIDAR文库排除rRNA后，大部分读取来自mRNA，这在基于连接的方法中几乎无法检测到。

作者将胚胎干细胞（ESCs）分化为神经祖细胞（NPCs），这一过程中基因表达变化显著。

使用LIDAR和传统mRNA-seq，检测到相似数量的差异表达基因，包括多能性基因和NPC标志物。LIDAR与mRNA-seq的表达模式、重叠度和折叠变化相关性都很高，LIDAR还准确量化了miRNA和snoRNA。

总之，LIDAR有效地同时分析了不同RNA群体的基因表达变化，但对于专门分析编码转录组或miRNA，专用方法仍然更好。

三. LIDAR在胚胎干细胞中揭示了长的3' tDRs

tDRs（tRNA衍生RNA）包括不同类型的3' tDRs。传统的连接方法对3' tDRs检测效率低，LIDAR则能有效捕获这些“无法克隆”的长3' tDRs。

通过LIDAR测序，作者发现了30-40 nt的长3' tDRs，这些片段在传统方法中难以检测。

改进的3'-LIDAR提高了对3'末端的覆盖，能更好地捕获长3' tDRs。LIDAR和3'-LIDAR的结果表明，这些长3' tDRs是在细胞内由成熟tRNA切割产生的。

四. 长3' tDRs在小鼠组织中呈现差异表达

作者研究了长3' tDRs在小鼠脑和睾丸中的表达是否具有组织特异性。

他们使用LIDAR和基于连接的方法构建的文库显示，LIDAR能够检测到更多种类的ncRNA，并且在脑和睾丸中识别出30-40 nt的长3' tDRs。这些长3' tDRs在不同组织中存在差异表达，LIDAR能够有效地量化这些差异。

五. LIDAR检测到3' tDRs上的RNA修饰

LIDAR能够检测到3' tDRs上的RNA修饰，如m1A，这些修饰通常会干扰传统的逆转录酶方法。

与PANDORA-seq相比，LIDAR在捕获更多种类的tDRs和检测修饰方面更为出色。LIDAR揭示了30-40 nt的3' tDRs可能来源于成熟tRNA的切割，并且具有修饰。

六. LIDAR克隆了3'端封闭的tRNAs和tDRs

LIDAR能够克隆3'端被修饰的RNA，这些修饰使得这些RNA在传统连接方法中难以被检测，而LIDAR有效地捕获了这些3'端封闭的tRNAs和其衍生片段。

七. LIDAR捕获了小鼠精子的转录本多样性

LIDAR能够捕获小鼠精子中的全面RNA种类，包括传统方法难以检测的3' tDRs和全长tRNAs。

与传统的连接方法相比，LIDAR更有效地识别了被阻断的3'端tDRs，并揭示了精子中的rRNA片段。

LIDAR提供了对精子RNA转录本的更全面分析，发现了在传统和PANDORA-seq方法下未能检测到的长3' tDRs。

总结

本文开发的LIDAR是一种新型测序方法，能够捕获所有长度和30端修饰的RNA，包括编码和非编码RNA。它利用准随机引物扩增和模板转换，克服了传统方法的局限性。LIDAR全面表征了小鼠的转录组，发现了比传统方法更多的tRNA衍生小RNA（tDRs），特别是那些具有阻断3'端的tDRs。这使得LIDAR能够揭示样本中的所有RNA种类及其潜在功能。

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