Cell | 张锋团队揭示真核基因编辑系统Fanzor的结构与DNA切割的机制

导读

Fanzor（Fz）是一种真核可编程ωRNA引导的核酸内切酶。Fz和原核的CRISPR-Cas12系统起源于不同的TnpB变体，TnpB是一种广泛存在的原核生物中依赖可移动元件引导活性的系统（OMEGA）。

与Cas12类似，Fz家族中存在显著的多样性。Fz主要分布于原口动物、藻类、真菌和单细胞真核生物中，并被分为两个不同的家族：Fz1和Fz2。

Fz2在蛋白质结构上与TnpB表现出很强的相似性，而Fz1则大得多，暗示了它们可能具有不同的功能和机制。

2024年8月28日，博德研究所张锋团队在Cell上发表了一篇题为“Structural Insights into the Diversity and DNA Cleavage Mechanism of Fanzor”的论文，通过解析了三种Fz1蛋白的冷冻电镜(cryo-EM)结构，揭示了ωRNA结合和DNA识别的共同点和不同点，为Fz1蛋白通过多种机制实现其内切酶活性的特异性和效率提供了新见解。

文章索引【标题】Structural Insights into the Diversity and DNA Cleavage Mechanism of Fanzor

【发表期刊】Cell

【发表日期】2024年8月28日

【作者及团队】博德研究所张锋团队

【IF】66.85

研究结果

一. GtFz1、SpuFz1和PpFz1复合物的结构

研究团队之前发现，GtFz1和SpuFz1在体外具有RNA引导的DNA切割活性，分别识别TAMs为5'-CATA-3'和5'-TTAA-3'，对PpFz1的筛选确定其识别5'-ATN-3'的TAM并能切割DNA。

作者通过在酵母中表达和纯化GtFz1、SpuFz1和PpFz1核糖核蛋白（RNPs），作者使用冷冻电镜解析了它们的结构。

结果显示，三种Fz1蛋白具有相似的双叶结构和保守的RNA引导DNA结合机制，但PpFz1在RuvC结构域中有一个独特的Fanzor RuvC插入（FRI）结构域，该结构域可能与环孢素（Cyp）蛋白相互作用，表明其功能上有特异性。

二. ωRNA结构及其与Fz1的相互作用

不同物种的Fz蛋白具有显著不同的ωRNA长度，但其ωRNA结合界面较为保守，主要包括RuvC/TNB和RuvC/WED结构域的连接处。

ωRNA的第一个发夹结构（SL1）在所有Fz1中都保守，可能在Fz1功能中起重要作用。虽然各物种的ωRNA在支架区域的结构有所不同，但SL1以外的区域似乎对Fz1功能并不关键。

三. 靶标DNA识别机制

三种Fz1蛋白通过WED和REC结构域识别DNA的TAM区域，保守的精氨酸残基提供稳定性。

靶标DNA解链后，Fz1蛋白稳定解开的DNA状态，并与引导RNA/DNA异源双链结合。

GtFz1的异源双链为8个碱基对，而SpuFz1和PpFz1为15个碱基对，RuvC结构域的构象决定了双链长度的容纳能力。

四. GtFz1具有非典型催化三联体

GtFz1具有非典型的RuvC催化三联体，第三个催化残基为天冬酰胺（N）而非天冬氨酸（D）。

尽管这种替代不提供正电荷，但GtFz1仍保持切割活性，并在DNA切割中表现出独特的离子依赖性。类似突变对SpuFz1增强了活性，而对Cas12和TnpB没有显著影响。

五. GtFz1在DNA切割中的构象动态

在Fz1的DNA切割中，R-loop形成前后，REC结构域和RNA引导区域经历了显著的构象变化。GtFz1显示了与NTS结合相关的动态变化，并且活性域的灵活性导致其切割产物更加异质化，与SpuFz1的稳定性形成对比。

六. SpuFz1的RuvC结构域表现出结合双链DNA能力

在SpuFz1中，作者通过体外切割实验和冷冻电子显微镜分析，发现即使切割位点或相邻核苷酸被阻断，未被阻断的位点仍会被切割。这表明SpuFz1能够在部分修饰的DNA底物上形成R-loop。

结构分析显示，RuvC结构域可以容纳双链DNA，并在不同状态下显示DNA的弯曲和切割，这与TnpB和大多数Cas12的机制不同，也表明了Fz1在R-loop形成中有独特的机制。

七. RuvC调控SpuFz1中的R-loop结构和DNA切割

在SpuFz1的DNA切割研究中，作者发现RuvC域的“盖子”区域在R-loop结构和DNA切割中起重要作用。

作者通过对不同DNA底物进行切割实验及冷冻电镜分析，识别出多个构象状态。状态V和VI显示，“盖子”区域的不同构象在DNA结合和切割过程中扮演关键角色，特别是盖子区域的向下转动形成了一个小的裂缝，有助于靶DNA的结合和切割。这些发现表明盖子区域在SpuFz1的活性中至关重要。

八. PpFz1中由异二聚体驱动的激活中ωRNA 5'端调控动态

在PpFz1中，作者识别了四种状态：状态I（3 bp异二聚体）、状态II（8 bp异二聚体）、状态III和IV（15 bp异二聚体）。状态I中，盖子向上，RuvC未结合DNA；状态II中，盖子向下但DNA未结合；状态III中，15 bp异二聚体与RuvC结合，表示活跃状态；状态IV中，DNA切割后单链DNA绑定于RuvC盖子和TNB小裂缝。盖子区域在调控DNA结合和切割中起关键作用，并可能在相关蛋白中保守。

总结

Fanzor是一种ωRNA指导的内切酶，具有独特的基因编辑能力。本研究揭示了Fz的结构、DNA识别机制及其非典型的催化位点。Fz通过改变RuvC域的盖子环来调控内切酶的激活和DNA解旋。这些发现为Fz的机制提供了新的理解，并推动基因编辑工具的发展。

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