综述 | 从顺式到反式：小开放阅读框（smORFs）功能在进化中出现

导读

数十万个小于100个密码子的小开放阅读框（smORFs）广泛存在于每个基因组中，尤其是在长非编码RNA（lncRNA）和mRNA的5′非翻译区中。

尽管smORFs通常被认为是无功能的，但Ribo-seq（核糖体印迹分析）表明，有数千个smORFs会被翻译。

已被研究的smORF功能从个例逐渐展现出可识别的规律：smORFs可以具有顺式非编码调控功能（涉及低水平翻译的无功能肽）或完全的编码功能（由强翻译的多肽介导），这些多肽通常作为膜相关的调节因子，发挥细胞和生理作用，并调控经典蛋白质。进化背景表明，许多smORFs是非编码序列新生的基因。

2024年11月26日，西班牙安达卢斯中心Juan Pablo Couso团队在Trends in Genetics上发表了一篇题为“Cis to trans: small ORF functions emerging through evolution”的综述，认为顺式非编码smORF功能为后续进化出完整肽功能提供了生态位。

文章索引

【标题】Cis to trans: small ORF functions emerging through evolution

【发表期刊】Trends in Genetics

【发表日期】2024年11月26日

【作者及团队】西班牙安达卢斯中心Juan Pablo Couso团队

【IF】13.6

综述整理

一. 短编码序列的世界

1.1）小开放阅读框（smORFs）介绍

smORFs是能翻译成小肽或短蛋白（小于100个氨基酸）的DNA或RNA序列，起始于ATG/AUG（或非经典起始密码子）并以终止密码子结束。真核生物基因组中smORFs数量从果蝇的数十万到人类的数百万不等，其中许多映射到潜在的非编码RNA上。

过去，smORFs因数量多、规模小及功能研究不足而被视为非编码，未被注释。如今，越来越多证据表明，数百至数千个smORFs可被翻译，其短肽可能具有重要功能并在进化中高度保守，揭示了基因组中可能存在一个“隐藏的基因组”。

1.2）smORFs 的分类与功能

smORFs平均约25个密码子，大小和数量分布符合随机起源。根据基因组特征，smORFs分为从无功能基因间ORFs到调控经典蛋白的功能性序列。

数万个（10%）出现在RNA转录本中，包括mRNA的uORFs、dORFs和lncORFs，常呈多顺反子排列。约1000个（1%）翻译为80个氨基酸左右的短肽或短蛋白（sCDSs），通常是短mRNA中唯一的编码ORF。

1.3）smORFs 的研究进展与挑战

smORF功能研究因其短小的特性难以检测或通过同源性识别。早期在酵母中首次提出“smORF问题”，注释时人为设定100个氨基酸长度限制（细菌为50个），导致smORFs长期局限于原核研究。

在果蝇中，研究发现了由tarsal-less (tal)基因编码的11个氨基酸的多肽，尽管该基因最初被标注为lncRNA，但实际上具有编码功能，对发育至关重要，并且在节肢动物中保守。

类似的研究还发现了调控肌浆网钙泵的sarcolamban smORF家族，其中包括人类的sarcolipin（30个氨基酸），这些肽展示了惊人的功能和结构保守性，追溯到约5亿年前。

1.4）smORFs与de novo基因进化

smORFs研究与de novo基因进化交叉，显示高达2%的编码基因无同源基因。研究认为，这些基因可能源于介于惰性DNA与完整蛋白之间的原始基因。

进一步假设，smORFs包含非编码原始基因和年轻编码基因，研究其系统发育变化或揭示新基因进化机制。

本文研究团队提出“顺式到反式路径”模型，解释非编码smORF如何转变为编码基因。

二. Ribo-seq技术：smORF检测的利器

ORFs随机出现在核酸序列中，仅凭存在无法证明其功能。要确认数万转录的smORFs中哪些具功能，需先确定其是否翻译。

传统的单基因方法（如遗传分析、报告基因检测）已被高通量测序技术补充。部分smORF编码肽（SEPs）通过蛋白质组学检测到，但仅仅高翻译水平的smORFs才容易被发现。

Ribo-seq核糖体印迹分析作为基因组范围内检测翻译的工具，有效地揭示了果蝇和脊椎动物中数百个smORFs的翻译，但是Ribo-seq仍因样本需求大、单基因聚焦和灵敏度低限制了其在基因组范围内的应用。

Ribo-seq显示sCDSs翻译效率（TE）高，与经典蛋白相当，而lncORFs和uORFs翻译较少且TE低。约30%的果蝇lncRNA含smORFs，可翻译保守性小肽，表明进化对smORF功能的重要性。虽多数lncORFs翻译随机，但部分经进化选择的smORFs具有功能。

三. 基因组层面smORF功能的探究

近年来，高通量测序与功能基因组学揭示smORFs功能。研究者发现大多数新短ORF无功能，但部分在应激下具适应性优势，支持“跨膜域优先”模型。果蝇研究表明少数smORF对线粒体功能关键。

有研究者在人类研究中通过Ribo-seq和CRISPR发现，部分uORF肽具反式功能，或与主要ORF协同调控翻译，展现双顺反子操纵特性，这些成果拓展了对smORF功能与进化的理解。

四. 单个smORF功能探究

单基因研究虽更能揭示smORF功能，但因突变靶点小、肽段不稳定，实施较难。然而，近期研究巩固既有趋势并提出新假设。

4.1）与膜相关的sCDS肽

许多小分子蛋白都涉及膜相关功能，支持smORF肽作为膜功能调节因子的角色：

1. Bouncer是一个80个氨基酸的小分子蛋白，促进物种特异性受精。

2. Kuduk编码的78个氨基酸跨膜蛋白与细胞骨架连接，调控LINC复合体连接细胞核与骨架。

3. Pegasus是一个80个氨基酸的分泌肽，调节Wingless/Wnt1信号扩散

4. Purriato是一个77个氨基酸的小分子蛋白，维持肌肉应激下蛋白稳态。

4.2）长非编码RNA编码的肽

长非编码RNA（lncRNA）编码的肽（lncORF）具有重要功能：

1. Linc-miprep 和 Linc-wrb：调节运动行为和神经发育，影响神经前体细胞。

2. pTUNAR：调节内质网钙离子水平，在不同细胞类型中发挥不同功能。

3. pTINCR：促进角质形成细胞增殖和上皮分化，抑制皮肤癌恶性度。

4. PACMP：增强化疗耐药性，通过维持CtIP稳定性和促进DNA修复。

这些肽在癌症研究中具有潜力，可作为新药物靶点。

五. 顺式功能：一种通过非编码路径实现肽功能的方式

研究发现，与miRNA相关的lncORF翻译增强miRNA功能，作用机制在于翻译过程而非肽本身。

此结果支持smORF的顺式调控作用，并揭示从非编码到编码的演化路径，表明其在膜相关蛋白调控中具有重要意义。

总结

近期研究表明：1）smORF只有少数被翻译；2）在已翻译的smORF中，只有少数具有功能。尽管大部分smORF无功能或略有害，但它们仍可能作为新基因的进化来源。未来需深入探索非编码序列偏向及其与基因演化、生命起源的关系。

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