NBE | 高效合成环状RNA，实现强效滚环翻译

导读

外源mRNA引入细胞后可表达目标基因（GOI），构成了mRNA治疗的基础。然而，由于不稳定性、高免疫原性和低效递送等问题，其发展进展缓慢。尽管核苷酸修饰和RNA递送技术推动了mRNA疫苗的成功，mRNA的不稳定性仍制约了其他应用。

环状RNA（circRNA）因抗外切酶而更稳定，是mRNA疗法的潜在替代品。天然circRNA既可作为microRNA和蛋白质的海绵，又可作为翻译模板。在内部核糖体进入位点（IRES）支持下，circRNA可高效翻译。

无终止密码子的circRNA可通过滚环翻译（RCT）生成多蛋白质，效率理论上比单次翻译高100倍，但面临两个问题：起始效率低和环化引入附加序列。

circRNA可通过化学、酶促连接或基于I型内含子的置换内含子–外显子（PIE）方法体外合成。其中PIE效率较高，但存在长RNA低产量、免疫原性及无法合成修饰circRNA等局限性。

circRNA的鉴定同样存在挑战，现有方法多受限于分离效果、长度或批次间差异，需要更通用可靠的检测手段。

2024年12月13日，英国剑桥MRC分子生物学实验室V. Ramakrishnan团队在Nature Biomedical Engineering上发表了一篇题为“Efficient circular RNA synthesis for potent rolling circle translation”的论文，报告了高效且精确的circRNA合成技术，以及用于探究circRNA的简单分析方法，为circRNA在治疗应用中的潜在价值提供了支持。

文章索引

研究结果

一. TRIC高效合成环状RNA

I型内含子可作为反式核酶，通过连接目标序列3′端实现环化（TRIC）。

作者选用活性高、序列短的Anabaena tRNA_Leu内含子，设计TRIC-V0环化3×Flag序列，并通过凝胶、洗脱、RT-PCR和测序确认其环状结构。

另外，他们引入延伸引导序列（EGS）和内环优化为TRIC-V1，进一步提高环化效率，其中V1.0表现最佳，用于后续的优化。

二. 新方法实现超过8000 nt环状RNA的合成

V1.0在环化长目标基因（GOI）方面效率高于PIE，尤其对>8000 nt的RNA表现出优异性能。

作者通过降低Mg²⁺浓度抑制共转录环化，可有效减少RNA断裂。转录后环化是合成>5000 nt环状RNA的关键步骤，V1.0和PIE在短时环化效率上相当，但PIE难以生成超长环状RNA。

三. 天然琼脂糖凝胶可将环状RNA与其线性对应物分离

天然琼脂糖凝胶可有效分离环状RNA与线性RNA，环状RNA迁移速度较快。随着琼脂糖浓度增加，分离效果增强，3%凝胶中环状RNA迁移较慢，通过RNase R消化可以确认其环状特性。

四. 尿素-琼脂糖凝胶系统能有效分离环状RNA与其线性对应物

在变性尿素–琼脂糖凝胶中，环状RNA比线性RNA迁移得更慢，分离效果随尿素和琼脂糖浓度增加而增强。

延长电泳时间或提高功率有助于提高分离效果，这是一种快速鉴定环状RNA的方法。

五. TRIC-V2 实现了RNA环化而无需引入不必要的序列

理想的TRIC构建应具备最小序列需求并保持高效性。V2构建通过改变结构而非序列，能高效环化，无需原生剪接序列，最小需求为7 nt环和≥5 bp茎，该方法可有效环化长蛋白编码circRNA，且易于工程化。

六. TRIC-V2比PIE更快速

V2（25 bp 茎环）环化效率显著优于PIE，1分钟转化超半数线性RNA，8分钟效率达97.8%，产率74.8%，这一优化方案可推广至其他I类内含子。

七. 环状RNA的免疫原性较低

环状RNA免疫原性较低，但V2与PIE环状RNA差异尚不确定。

优化纯化后，PRH纯化的环状RNA几乎无免疫反应，支持环状RNA免疫原性低的观点。

八. 改良环状RNA的合成与免疫原性

TERIC技术可高效合成100%修饰的环状RNA，解决了PIE和TRIC无法实现的问题。修饰的环状RNA显著降低免疫原性，但m6A修饰仍可能诱导部分RIG-I表达。

九. TRIC circNluc产生的蛋白质比PIE circNluc多

TRIC circRNA（V2 circNluc）在A549细胞中的蛋白表达在第2天达到峰值，并且在第3天仍显著高于第1天，而PIE circNluc表达在第1天达到峰值后没有再增加。

十. RCT的翻译效率提高了超过7000倍

RCT主要生成多肽蛋白，可以通过2A跳跃序列转化为蛋白单体。使用强效短IRES（OR4F17）构建的circOR4F17-Nluc-RCT生成了大量蛋白，但效率低于N1Ψ修饰的mRNA。

作者测试了CSFV IRES后，发现去除停顿密码子的设计使得RCT的翻译效率比OR4F17 IRES提高了7000倍。

总结

本文介绍了一种合成方法，可高效合成超过8000个核苷酸的circRNA，且不依赖细菌序列。此方法比传统的内含子-外显子重排方法效率更高，且生成的circRNA具有低免疫原性和较高的翻译效率，促进了circRNA的治疗应用潜力。

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