NAR | Ribo-seq应用：揭秘线粒体无5' UTR mRNA翻译——起始tRNA和密码子的选择如何影响能量生成

导读

哺乳动物线粒体具有独特的蛋白质合成系统，专门合成氧化磷酸化复合体的13个亚基。其翻译机制类似于细菌，但已演化出特异性功能，如合成疏水性膜蛋白并促进共翻译膜插入。翻译因子虽保留细菌同源核心结构，但常有额外序列，以增强与核糖体、tRNA和mRNA的特异性相互作用。

线粒体DNA编码13种蛋白，其来源于9种单顺反子和2种双顺反子mRNA，其中11 个mRNA无5′ UTR序列，并采用非通用遗传密码。

翻译起始由IF-2mt和IF-3mt执行，IF-2mt促进fMet-tRNA结合55S核糖体，而线粒体缺乏细菌IF-1，其功能由IF-2mt内部37个氨基酸插入序列取代。IF-3mt具有核糖体解离活性，并参与双顺反子mRNA下游阅读框的翻译。

不同于细菌的SD序列依赖起始，线粒体起始主要依赖IF-2mt直接募集无5′ UTR的mRNA和fMet-tRNA到55S核糖体。线粒体仅用一种tRNAMet进行起始和延长，并频繁使用非AUG起始密码子，如ND2以AUU起始，ND1、ND3和ND5以AUA起始。

2025年1月29日，东京大学Nono Takeuchi-Tomita团队在Nucleic Acids Research上发表了一篇题为“Selection of initiator tRNA and start codon by mammalian mitochondrial initiation factor 3 in leaderless mRNA translation”的论文，利用体外重构的线粒体翻译系统，发现IF-3mt在保证哺乳动物线粒体无5′ UTR mRNA翻译起始的准确性方面具有重要作用，并促进无5' UTR mRNA的翻译起始。

索引

【IF】16.97


研究结果

一. IF-3mt对起始tRNA的选择依赖其反密码子茎第30:40位的GC或CG碱基对

作者通过重建哺乳动物线粒体翻译系统，研究了IF-3mt的校对功能。

IF-3mt通过鉴别起始tRNA反密码子茎中的3GC配对，促进5' UTR mRNA的准确翻译。实验发现，IF-3mt通过其特有的N和C末端扩展，放宽了对非AUG启动密码子的识别。

突变分析表明，IF-3mt主要依赖反密码子茎中的第二个GC配对（GC或CG）来选择起始tRNA。

二. IF-3mt选择起始tRNA反密码子与起始密码子的匹配，并允许从AUG启动密码子启动翻译

作者将HiBiT1 mRNA的起始密码子更改为AUG、AUU、AUA、GUG和ACG，并在有无IF-3mt变体的情况下进行翻译。

结果显示，所有IF-3mt变体均特异性地刺激了AUG密码子的翻译启动，表明IF-3mt通过选择与起始tRNA反密码子匹配的起始密码子来启动翻译，而末端扩展序列在此过程中没有特定作用。

三. IF-3mt的末端扩展序列及线粒体tRNAMet反密码子中的m5C/f5C修饰支持从非AUG起始密码子AUA启动翻译

研究表明，IF-3mt的末端扩展序列和线粒体tRNAMet的m5C/f5C34修饰有助于启动AUA而非AUG起始密码子。

四. IF-3mt缺失改变AUG和非AUG起始密码子启动的比例

缺乏IF-3mt时，原生mt-tRNAMet的翻译水平提高，AUG和AUA的翻译比例为1.1。有IF-3mt时，AUG和AUA的比例为0.42，表明IF-3mt更有效促进AUG的启动。

五. IF-3mt中的末端扩展和KKGK-motif有利于无5' UTR mRNA的翻译，并放宽非AUG起始密码子的筛选

IF-3mt的末端扩展和KKGK-motif有助于放宽对无5' UTR mRNA翻译的抑制，增强非AUG起始密码子的翻译能力，显示其在5' UTR mRNA翻译和起始密码子筛选中的宽松机制。

六. IF-3mt参与人类细胞中无5' UTR mRNA的翻译

Ribo-seq核糖体印迹分析显示IF-3mt在HEK293细胞中缺失导致线粒体mRNA翻译效率显著下降，尤其是ATP6和ND4等双启动子mRNA的内部ORF。

无5' UTR mRNA的翻译减少较轻，非AUG启动子影响较小，表明IF-3mt主要通过校对功能促进AUG启动子序列的翻译。

新合成的线粒体蛋白质减少，ATP6合成下降约50%，氧化磷酸化复合物亚基水平下降，尤其是ATP6和ATP8。IF-3mt缺失对IF-2mt和部分线粒体核糖体蛋白影响较小。总体而言，IF-3mt 促进无5' UTR mRNA的翻译。

总结

IF-3mt在哺乳动物线粒体翻译中通过校对功能促进无5' UTR mRNA的准确启动。它通过其特有的N端和C端延伸以及KKGK-motif，支持非AUG起始密码子的启动，放松了对非AUG密码子的区分。

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