NBT | 模仿自然编辑，提升RNA碱基编辑效率——引导RNA的创新突破

RNA编辑可暂时引入不可遗传的修饰，适用于治疗遗传病和复杂疾病。相较DNA编辑，RNA编辑具有可逆性，避免永久基因组改变，降低脱靶风险，但在面对长期治疗的情况下，RNA编辑的稳定性和效率上仍面临挑战。

目前定点RNA碱基编辑主要有两种策略：A）一是共表达编辑酶与向导RNA（gRNA）；B）二是仅递送gRNA以招募内源ADAR，这虽减少脱靶和潜在致癌性，但编辑效率较低。

为提高ADAR介导的编辑效率，gRNA设计通常包含一个与靶位点完全互补的区域，并设置A–C错配，有些还引入结构序列以增强ADAR结合。然而，ADAR更依赖RNA结构而非序列，靶位点周围的变异可显著影响编辑效果，因此在gRNA中引入多样结构有助于提高效率，尤其对单gRNA策略至关重要。

1）尽管已有如“−35位点规则”和“−26位点规则”等经验性设计原则，但效率提升有限且靶点依赖性强。

2）直接优化gRNA的策略，如错配扫描，亦受限于结构种类有限及组合空间庞大（如30-mer变异数达10¹⁸），难以通过细胞系统全面筛选。

3）目前主要依赖体外实验，但未能充分模拟ADAR真实环境，因此gRNA设计仍面临显著瓶颈。例如，随机突变法优化的gRNA在细胞中的编辑效率提升也仅约1.5倍。

文章索引

【IF】46.9

研究结果

研究者通过分析GTEx中的RNA-seq数据，识别出30多万对反向Alu序列，富集高度RNA编辑位点，具备典型ADAR编辑特征。

实验结果验证了这些反向Alu是理想的内源编辑模板，可用于指导高效gRNA设计。

作者发现，高编辑位点具有特定的三联序列特征，为gRNA设计提供了新线索。大多数位点富集cPCP序列，但对于GAN位点，替代设计（如−1位错配G–G或G–A）表现更好。

实验验证表明，某些替代设计在天然底物中比cPCP设计具有更高的编辑效率，提供了优化gRNA设计的潜力。

作者提出了MIRROR方法，通过设计gRNA模拟倒位重复序列的结构，优化RNA编辑效率。

该方法通过构建一个高通量筛选系统，评估gRNA在特定底物上的编辑效率，验证了结构特征对编辑效率的贡献。

实验结果表明，gRNA的编辑效率与底物的结构和未配对碱基的数量密切相关，最佳的结构设计可显著提高编辑效果。

为了优化短gRNA的RNA编辑效率，作者采用了MIRROR策略，并对41 nt长的gRNA进行了筛选，重点研究了不同位置的编辑效应。

他们首先在HEK293细胞中测试了这些gRNA，发现不同细胞系中gRNA的编辑效率高度一致，表明RNA编辑的结构规则在多种细胞类型中是保守的。

接着，他们发现编辑效率受gRNA 3′区域偏好影响，gRNA的3′端与目标位点的编辑效果最佳。

进一步使用化学修饰的gRNA测试后，团队确认了gRNA结构对编辑效率的提升作用，尤其是与ADAR结合的最佳结构。

最终，作者验证了不同病变位点的编辑效率，发现最优MIRROR gRNA在多个病变位点上表现出显著的编辑效率提升，比传统设计高2.5到5.7倍。

为了验证MIRROR gRNA的编辑能力，作者设计了针对Z等位基因的SERPINA1 mRNA的MIRROR gRNAs。

结果表明，MIRROR gRNAs在不同长度和浓度下均显示出比完全互补的A–A错配gRNAs更高的编辑效率，最高提高了2倍。

MIRROR gRNA通过脂质纳米颗粒递送，在小鼠体内实现高达81%的编辑效率，且编辑效果在7天内保持稳定，这表明MIRROR gRNA能有效在体内进行RNA编辑。

团队验证了MIRROR策略在质粒系统生成长gRNAs中的应用，结果表明，MIRROR gRNAs显著提高了编辑效率，尤其是针对非TAN模体的gRNAs，效率分别提高了1.7倍和2.8倍。

作者对MIRROR在多种细胞类型中与现有设计方法进行了比较，结果显示，在短化学合成gRNA和长生物生成gRNA形式下，MIRROR的编辑效率普遍高于其他方法。

MIRROR在大多数情况下提高了编辑效率，超越了RESTORE、LEAPER.v2、CLUSTER和圆形CLUSTER设计，证明其是一种适用于广泛细胞类型和生物体的高效工具。

为了简化MIRROR gRNA的设计，作者开发了一个程序，用户输入目标编辑位点和序列，程序自动生成1000-2000个候选gRNA。高通量筛选方法需要大约6周，低通量筛选方法则大约2周即可获得最佳gRNA。

作者还通过训练XGBoost模型，结合SHAP值分析，识别出提升编辑效率的关键特征，这些特征可应用于低通量筛选的gRNA设计。

本文介绍了MIRROR方法，通过模仿倒位的Alu重复序列结构，优化了gRNA设计以招募ADAR进行RNA碱基编辑。与现有方法相比，MIRROR显著提高了RNA编辑效率，适用于短链化学合成和长链生物合成gRNA，在多种人类细胞和小鼠肝细胞中表现出色。

点击图片查看

点击图片查看