PLoS Biol | Ribo-seq应用：张珞颖和陆剑团队揭示uORFs动态调节CLOCK蛋白翻译，调控昼夜节律和睡眠

昼夜节律通过转录–翻译反馈环（TTFL）维持约24小时的生物周期，该机制在多种物种中高度保守。节律系统驱动大量基因的时序性表达，调控增殖、信号传导、代谢、睡眠节律、癌症及神经退行性疾病等过程。尽管TTFL核心组分已明确，翻译等转录后调控机制仍未充分解析，而翻译调控可实现更快速精确的蛋白调节。

果蝇因其遗传易操作性和通路保守性，是研究节律的经典模型，其TTFL由CLK/CYC驱动per和tim表达，PER/TIM蛋白反馈抑制CLK/CYC。节律精度还受翻译与翻译后调控影响，如24/ATAXIN2促进tim/per翻译，bantam和mir-276a抑制CLK和TIM表达，PER/TIM也受翻译后修饰调节，但其调控网络仍未完全解析。

近年研究强调上游开放阅读框（uORFs）在节律调控中的作用。uORFs位于mRNA 5′ UTR，可通过干扰翻译起始抑制主CDS表达。

A）拟杆菌中，frq的uORFs调节FRQ蛋白水平，实现温度补偿。

B）拟南芥TOC1也受uORFs调控，尽管不同物种节律原理类似，具体蛋白差异显著。

C）在小鼠中，Per2的uORFs参与温度适应与睡眠调控，但对周期影响不大。

此外，哺乳动物节律基因mRNA中广泛存在具核糖体结合能力的uORFs，其功能仍待探索。总体来看，uORF介导的翻译调控在节律系统中的作用尚未全面揭示，可能关联多种生理与病理过程。

文章索引

【IF】9.995

研究结果

作者系统分析了果蝇基因组，发现节律相关基因显著富集uORFs，尤其是在核心节律基因中。高度保守的uORFs在这些基因中比例更高，具有更强的进化保守性。

Ribo-seq核糖体印迹分析显示多数uORFs具有翻译活性，尤其是保守uORFs。

进一步分析发现，保守且被翻译的uORFs显著抑制下游CDS的翻译，尤其是Clk基因，提示其uORFs在调控蛋白翻译中具有关键功能。

Clk是唯一含有高度保守并强烈抑制其CDS翻译的uORF的核心节律基因，研究发现其5' UTR包含5个典型uORF，uORF2和uORF3共享起始密码子且高度保守。

体内敲除Clk和cyc的uORF后，Polyosome profiling多聚核糖体分析发现Clk-uORF敲除线在白天多个时间点的多聚核糖体/单核糖体比值（P/M比值）明显升高，表明翻译效率增强。特别是在白天，CLK蛋白在早晨显著增加，表明uORF调控独立于蛋白降解。

CLK的磷酸化节律在敲除和野生型中无显著差异，表明uORF不影响其磷酸化。总体而言，Clk uORFs在日间抑制CLK翻译，可能通过与翻译机制节律性变化的相互作用调节。

为了定量评估Clk-uORF-KO对昼夜节律的影响，作者研究采用果蝇分子钟数学模型，模拟了Clk翻译增加的结果。模拟表明，增加Clk翻译会缩短昼夜周期，且与per和tim基因的表达升高相关。

实验结果验证了这一点，Clk-uORF-KO果蝇的昼夜周期比野生型缩短，表明Clk uORFs通过调节Clk翻译，影响分子钟的节律。

团队敲除Clk uORFs显著延长了果蝇睡眠时间，特别是在雌性果蝇中。Clk uORFs通过调节多巴胺信号促进早晨觉醒，缺失Clk uORFs导致ple基因表达下降，延长睡眠，而补充L-DOPA可逆转这一效应。

Clk uORFs通过调节Clk蛋白翻译，在季节性适应中调控果蝇的睡眠。

在短光周期下，Clk-uORF-KO果蝇的睡眠时间显著增加，表明Clk uORFs在调节光周期响应和睡眠持续性方面起关键作用。

Clk uORFs缺失影响果蝇基因表达的节律性，尤其在睡眠相关基因上。雌性果蝇的变化更为显著，主要富集在代谢通路。

缺失Clk uORFs增加了循环基因的数量和振幅，且在性别上有所差异。

Clk-uORF-KO果蝇在饥饿和繁殖方面表现出显著的适应性下降。

与WT果蝇相比，Clk-uORF-KO在饥饿应激下死亡率更高，并且产卵数量显著减少，后代产量也较少。这表明Clk uORFs不仅在昼夜节律和睡眠调控中起重要作用，还影响代谢适应性和生殖能力。

本文发现果蝇的核心昼夜时钟基因Clock（Clk）中的上游开放阅读框显著调控CLK蛋白的翻译，尤其在白天抑制其翻译。去除Clk uORFs会导致CLK蛋白水平升高，昼夜周期缩短，并改变时钟基因的表达节律。同时，Clk uORFs也调节睡眠模式，响应季节性光照变化，并影响多种生理过程。研究揭示了uORFs在适应环境变化中的重要作用。

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